Die Interdependenz zwischen zahnärztlicher Behandlung und Herpesreaktivierung - Klinische und subklinische Reaktivierungen von HSV1

Textprobe Kapitel 3.2.2.4, HSV-1 Southern Blotting: Unter UV-Licht wurden die DNA-Bande aus dem Agarosegel herausgeschnitten. Denaturierung Um die Doppelstränge der DNA zu trennen, wurden - vor dem Transfer auf die Nylonmembran - die DNA-haltigen Gelstücke zweimal für je 30 min in Denaturierungspuffer bei 21 ° C inkubiert. Die Gelstücke wurden für ca. 15 min in Southern Transfer Puffern geschwenkt, danach die einzelsträngige DNA mit Hilfe des S&S Turbo Blotters alkalisch auf eine Nylonmembran transferiert. Die Nylonmembran wurde gleichzeitig in destilliertem Wasser angefeuchtet. Der Turbo Blotter wurde folgendermaßen beschickt: 20 dicke Filterpapierblätter, 4 dünne Blätter und ein dünnes, in Transferpuffer angefeuchteten Blatt. Die angefeuchtete Nylonmembran wurde darauf gelegt und mit den feuchten Gelstücken bestückt. Dabei ist darauf zu achten, dass Luftblasen vermieden werden. Die Schichtung wurde um 3 im Puffer genässte dünne Filterpapiere ergänzt. Den Abschluss bildete ein großes Filterpapierblatt. Die Enden dieses Papierblattes reichten auf beiden Seiten in eine mit Transferpuffer gefüllte Wanne, um die Kapillarkräfte während des Blottens aufrecht zu erhalten. Schließlich wurde eine zum Blotter gehörige Deckpappe (Wick Cover) aufgelegt. 2. Neutralisierung Nach 70 min wurde der Transfervorgang gestoppt und die Nylonmembran für 5 min in Neutralisationspuffer gelegt und gewaschen. 3.Cross-linking und Trocknung Die Membran wurde zur DNA-Fixierung für einige Minuten unter UV-Licht gelegt und zusätzlich bei 80 ° C für 20 min im Heissluftschrank getrocknet. 4. Prähybridisierung Die Inkubation der geblotteten Nylon-Membran fand für 60 min in Vorhybridisierungslösung bei 68 ° C im Wasserbad statt. Um die Doppelstränge der Sonden-DNA zu trennen, wurden pro Membran 12 µl Sonde in 12 ml Prähybridisierungslösung gegeben und für einige Minuten aufgekocht. 5. Hybridisierung Die Hybridisierung der DNA erfolgte bei leichtem Schwenken mit digoxygenin-markierter DNA-Sonde und vollzog sich in einem Wasserbad bei 68 ° C für 16 - 24 Stunden. Bei der DNA-Sonde handelte es sich um eine Plasmid-DNA, die die komplementäre HSV-1-gB-Sequenz enthielt.